rt(rt-尊龙凯时人生就得博

rt-pcr就是逆转录pcr或称为反转录pcr，是以rna为材料应用于pcr扩增中的一种实验方法。一步法rt-pcr，逆转录同pcr扩增结合在一……

 

前言rt-pcr就是逆转录pcr（reverse transcription pcr）或称为反转录pcr（reverse transcription-pcr，rt-pcr），是以rna为材料应用于pcr扩增中的一种实验方法。

首先通过逆转录酶将总rna或信使rna（mrna）转录成互补dna（cdna）其次taq dna聚合酶以cdna为模板进行qpcr扩增rt-pcr已被广泛应用于多种分子生物学应用中，包括基因表达分析、基因测试、rna干扰验证检测、微阵列验证、病原体检测和疾病研究。

rt-pcr的方法之一步法和两步法rt-pcr其操作方法分为两种，即一步法和两步法一步法rt-pcr，逆转录同pcr扩增结合在一起，即cdna合成与pcr扩增反应在同一管buffer及酶中进行，一步完成。

两步法rt-pcr，rna首先在反转录酶的作用下生成cdna，再以cdna为模板进行pcr扩增，分成两步进行

两种方法如何选择及优缺点对比

rt-pcr中模板的选择在rt-pcr 实验中，选择总rna或纯化的mrna作为模板进行逆转录十分重要mrna虽然能提供略高的灵敏度，但总rna经常使用，具有较mrna更重要的优势第一，其过程需要较少的纯化流程，这保证了更好的回收模板和更好的把结果标准化为起始的细胞数。

第二，避免mrna富集步骤，为了避免不同mrna的回收率而带来结果偏移的可能性总之，在大多数的应用中，目标基因的相对定量比检测的绝对灵敏度更重要，因此在多数情况下，总rna更适用反转录酶的选择反转录酶（reverse transcriptase）又称逆转录酶。

是以rna为模板指导dntp合成互补dna（cdna）的酶一部分反转录酶具有rna酶活性，能够在转录后降解rna-dna杂交链中的rna链如果反转录酶没有rnase酶活性，可加入rnaseh来获得更高的qpcr效率。

常用的酶包括money鼠白血病病毒（mmlv）反转录酶和禽成髓细胞瘤病毒（amv）反转录酶依据rt-pcr，理想的状态下是选择具有较高热稳定性的反转录酶，cdna的合成才能在较高的温度下进行，确保成功转录具有较高二级结构的rna，并确保在整个反应过程中的全部活性，从而得到质量更高的cdna。

rt-pcr引物的选择逆转录引物一般包含3种：oligo dt引物，随机引物和特异性引物。对于短的且不具备发卡结构的真核细胞mrna，三种都可用。

rt-pcr引物设计原则1. 上下游引物要保守：扩增子长度需选择一段保守片段（100-200 bp）进行pcr扩增，选择片段需跨越内含子，因内含子的基因组dna序列不会被扩增，也可减少从污染的基因组dna中扩增得到的假阳性风险。

引物选取同样需要保守2. 引物长度和tm值：引物设计长度为18-25 bp，tm值在50-65℃之间，引物中gc含量在40-60%设计引物时尽量避免出现4个或超过4个g碱基rt-pcr实验阴性对照反转录阴性对照应包括在所有的rt-pcr的实验中，用来检测dna是否污染（如基因组dna或pcr产物）。

该对照所指不加反转录酶，通过反转录过程得到cdna在进行荧光定量pcr检测如检测到扩增，则样本中可能含有基因组dna污染

免责声明：本站所有信息均搜集自互联网，并不代表本站观点，本站不对其真实合法性负责。如有信息侵犯了您的权益，请告知，本站将立刻处理。联系qq：1640731186